ความเข้มข้นของ ochratoxin A ในตัวอย่าง mg/kg

ขีดจำกัดข้อผิดพลาดสัมพัทธ์ (ดัชนีความแม่นยำ) (±d), %, R = 0,95

ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานความสามารถในการทำซ้ำ (s r), %

ขีด จำกัด ความสามารถในการทำซ้ำ ( r), %

ความสมบูรณ์ของการสกัดสาร%

4. เครื่องมือวัด อุปกรณ์เสริม เครื่องแก้ว น้ำยาและวัสดุ

4.1. เครื่องมือวัด

4.2. อุปกรณ์เสริม


เครื่องเขย่าตัวอย่างประเภท АВУ-6С หรือใกล้เคียง	มธ 64-1-2451
เครื่องระเหยแบบหมุน IR-1M พร้อมกับดักหรือที่คล้ายกัน	มธ 25-11917
ตู้อบแห้งในห้องปฏิบัติการที่มีข้อผิดพลาดในการบำรุงรักษาอุณหภูมิ ±2.5 ในช่วง 50 ถึง 350 °C	มธ 16-531.639
ของใช้ในครัวเรือนตู้เย็น
เครื่องบดสำหรับห้องปฏิบัติการไฟฟ้า EM-3A หรือเครื่องวัดค่า pH ที่คล้ายกัน	มธ 46-22-236-79
เครื่องกวนแม่เหล็กแบบ MM 5 พร้อมแท่งกวน	มธ 25-11.834-80
ขวดรูปกรวยก้นแบน 250 ซม. 3 พร้อม NSh 29 ชนิด KnKSh 250-29/32	GOST 10394-74
ขวดสกรูแก้วสีเข้ม (เลว) ปริมาตร 7 ซม. 3
ขวดปริมาตร ความจุ 100, 500, 1000 ซม. 3 ชนิด 2-100-2,2-500-2
ห้องปฏิบัติการช่องทาง
ขวดรูปลูกแพร์ 10 ซม. 3 มี NSh 14.5 พิมพ์ GrKSH-10-14/23	GOST 10394-72

4.3. รีเอเจนต์และวัสดุ


โซเดียม ฟอสเฟต monosubstituted, 2-น้ำ, chda
โซเดียมคลอไรด์ เคมีบริสุทธิ์
อะซีโตไนไตรล์ เกรดความบริสุทธิ์สูง 0
เมทานอล osch
กรดฟอสฟอริกมีความบริสุทธิ์สูง	มธ 2612-014-00203677-97
กรดอะซิติกน้ำแข็งบริสุทธิ์ทางเคมี
Toluene, chda
คอลัมน์ภูมิคุ้มกัน Ochraprep (R-Bioharm สหราชอาณาจักร)

. เตรียมเข้าวัด

5.1. การเตรียมสารละลายมาตรฐานของ ochratoxin A

เพื่อเตรียมสารละลายในการเก็บรักษามาตรฐาน (ความเข้มข้นของ ochratoxin A คือ 10 ng / μl) ให้ใส่ตัวอย่างผลึก ochratoxin A ขนาด 5 มก. ลงในขวดปริมาตรขนาด 500 ซม. 3 ส่วนผสมของกรดโทลูอีน - อะซิติก 50 ซม. 3 (98 :2% vol.) เทลงไป คนอย่างระมัดระวังจนละลายสารจนหมด และนำส่วนผสมของตัวทำละลายเดียวกันมาทำเครื่องหมาย ในการสร้างความเข้มข้นที่แน่นอนของโซลูชันการจัดเก็บ ความหนาแน่นของแสงจะถูกวัดที่ความยาวคลื่น 333 นาโนเมตร (D 333) ความเข้มข้นของสารละลายคำนวณโดยสูตร:

นอกจากนี้ 5 ซม. 3 ของสารละลายมาตรฐานของ ochratoxin A ที่มีความเข้มข้น 10 ng/μl ถูกเจือจางด้วยส่วนผสมของกรดโทลูอีน-อะซิติก (98: 2% vol.) ถึงปริมาตร 100 ซม. 3 เพื่อให้ได้สารละลายที่ใช้งานได้ ด้วยความเข้มข้น 0.5 ng/μl

สำหรับการเตรียมสารละลายการทำงานของ ochratoxin A ที่มีความเข้มข้น 0.005 0.05 และ 0.1 ng/µl ตามลำดับ 50, 500 และ 1,000 µl ของสารละลายที่มีความเข้มข้น 0.5 ng/µl จะถูกระเหยจนแห้งและละลายในเฟสเคลื่อนที่ 5 ซม. 3

สารละลายในการเก็บรักษาโอคราทอกซิน A ถูกเก็บไว้ในภาชนะแก้วที่มีจุกปิดพื้นในที่มืดและเย็น (ที่อุณหภูมิประมาณ 0 ° C) นานถึงหนึ่งปีและใช้เพื่อเตรียมสารละลายมาตรฐานที่ใช้งานได้ สารละลายมาตรฐานในการทำงานจะถูกเก็บไว้ในขวดแก้วสีเข้มในที่มืดและเย็น (ที่อุณหภูมิประมาณ 0 °C) เป็นเวลา 1 เดือน

ก่อนใช้สารละลายมาตรฐานในการทำงาน ควรนำไปที่อุณหภูมิห้องแล้วจึงควรเปิดสต็อปเปอร์เท่านั้น

5.2. การเตรียมสารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต pH = 7.4

ส่วนหนึ่งของโซเดียมฟอสเฟตที่ถูกแทนที่ด้วยน้ำหนัก 12 อันที่มีน้ำหนัก 1.15 ก. ส่วนของโซเดียมโมโนแทน 2 น้ำที่มีน้ำหนัก 0.124 ก. และโซเดียมคลอไรด์ส่วนหนึ่งที่มีน้ำหนัก 1.74 ก. จะถูกโอนไปยังขวดปริมาตรที่มีความจุ 100 ซม. 3, 10 - 20 เติมน้ำกลั่น 3 ซม. ผัดและนำปริมาตรของสารละลายในขวดไปทำเครื่องหมาย อายุการเก็บรักษา - 1 เดือนในตู้เย็น

5.3. การเตรียมของผสมตัวทำละลาย

โทลูอีน-อะซิติก กรด (98:2 % เกี่ยวกับ.).

ในขวดปริมาตร 1000 ซม. 3 เติมกรดอะซิติก 20 ซม. 3 และคนให้เข้ากันด้วยโทลูอีน อายุการเก็บรักษา - 1 เดือนในที่มืดและเย็น

อะซิโตไนไตรล์-น้ำ (60:40 % เกี่ยวกับ.).

ในขวดปริมาตร 1000 ซม. 3 ให้เติมอะซิโตไนไทรล์ 600 ซม. 3 และคนให้เข้ากันด้วยน้ำ อายุการเก็บรักษา - 1 เดือนในที่มืดและเย็น

อะซิโตไนไตรล์-น้ำ (60:40 % เกี่ยวกับ.; pH = 3 ,0 ).

ในขวดปริมาตร 1000 ซม. 3 เติมอะซิโตไนไทรล์ 600 ซม. 3 แล้วคนให้เข้ากันด้วยน้ำที่ผ่านการกลั่น เมื่อเติมกรดฟอสฟอริก ค่า pH ของส่วนผสมจะถูกปรับเป็นค่าเท่ากับ 3.0 อายุการเก็บรักษา - 1 เดือนในที่มืดและเย็น

เมทานอล-อะซิติก กรด (98:2 % เกี่ยวกับ.).

ในขวดปริมาตร 1000 ซม. 3 เติมกรดอะซิติก 20 ซม. 3 และคนให้เข้ากันด้วยเมทานอล อายุการเก็บรักษา - 1 เดือนในที่มืดและเย็น

. การสุ่มตัวอย่างและการเตรียมตัวอย่างเพื่อการวิเคราะห์

6.1. การเลือกตัวอย่าง

เพื่อพิจารณาถึงความเฉพาะเจาะจงของการสุ่มตัวอย่างผลิตภัณฑ์บางประเภท หนึ่งควรได้รับคำแนะนำจากเอกสารด้านกฎระเบียบและทางเทคนิคในปัจจุบัน:

"ข้าวโพด. กฎการยอมรับและวิธีการสุ่มตัวอย่าง” GOST 13586.3-83;

“ครูปา. กฎการยอมรับและวิธีการสุ่มตัวอย่าง” GOST 26312.1-84;

“แป้งและรำ วิธีการยอมรับและสุ่มตัวอย่าง” GOST 27668-88;

“ผลิตภัณฑ์อาหารกระป๋อง การสุ่มตัวอย่างและการเตรียมการทดสอบ” GOST 8756.0-70

ตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์ ซึ่งเป็นตัวแทนของความเข้มข้นของสารพิษจากเชื้อราสำหรับทั้งชุดงาน ควรนำมาจากตัวอย่างเฉลี่ยก่อนการทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน (เริ่มต้น) ที่มีน้ำหนัก 2 กก.

6.2. การเตรียมตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์

ตัวอย่างที่เลือกจะถูกบดเป็นเวลา 1 - 2 นาทีในโรงสีในห้องปฏิบัติการ ในกรณีนี้ จะใช้ตัวอย่างคู่ขนานสองตัวอย่าง

6.2.1. การสกัด

ส่วนของตัวอย่างที่บดแล้ว 25 กรัมจะถูกใส่ในขวดทรงกรวยก้นแบนขนาด 250 ซม. และเติมส่วนผสมของน้ำอะซิโตไนไทรล์กับน้ำ 100 ซม. 3 (ปริมาตร 60:40%) สกัดในเชคเกอร์เป็นเวลา 30 นาที ส่วนผสมที่ได้จะถูกกรองผ่านตัวกรองกระดาษจีบแบบมีริบบิ้นสีน้ำเงิน เลือกตัวกรอง 10 ซม. 3 และเพิ่มสารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 90 มล. pH = 7.4

6.2.2. การทำให้บริสุทธิ์ของสารสกัด

ผสมผลลัพธ์ 100 มล. กับคอลัมน์อิมมูโนแอฟฟินิตี้ในอัตรา 1 - 2 หยดต่อวินาที ล้างด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 20 ซม. 3 pH = 7.4 Ochratoxin A ถูกชะด้วยส่วนผสมของกรดเมทานอล-อะซิติก 3 ซม. 3 (ปริมาตร 98:2 %)

. การวัดผล

7.1. การเตรียมตัวอย่างทดสอบ

สารชะจะระเหยจนแห้ง กากแห้งถูกละลายใน 400 ไมโครลิตรของเฟสเคลื่อนที่ (สารละลาย A)

7.2. เงื่อนไขโครมาโตกราฟี

เงื่อนไข HPLC: เฟสเคลื่อนที่ - อะซิโตไนไทรล์-น้ำ (60:40% ปริมาตร; pH = 3.0); ความเร็วเฟสเคลื่อนที่ - 1.5 ซม. 3 /นาที

เครื่องตรวจจับฟลูออไรด์ตั้งค่าความยาวคลื่นของการแผ่รังสีที่น่าตื่นเต้น 333 นาโนเมตร มีการติดตั้งตัวกรองการปล่อยก๊าซที่มีแบนด์วิดท์ 466 นาโนเมตรในท่อส่งก๊าซ

สำหรับการวิเคราะห์ตัวอย่าง 50 ไมโครลิตรของตัวอย่างทดสอบ (สารละลาย A) จะถูกฉีดเข้าไปในหัวฉีดโครมาโตกราฟีโดยใช้ไมโครเข็มฉีดยา ในการปรากฏตัวของจุดสูงสุดที่สอดคล้องกับเวลาการเก็บรักษาของ ochratoxin A มวลของ ochratoxin A ในการฉีดจะคำนวณโดยใช้กราฟการปรับเทียบ

. กำลังประมวลผลผลการวัด

8.1. การสร้างการพึ่งพาอาศัยกันที่สำเร็จการศึกษา

ในการสร้างกราฟการสอบเทียบ จะทำการวิเคราะห์ด้วยโครมาโตกราฟีของชุดโซลูชันการทำงานของมาตรฐาน ใช้ไมโครไซริงก์ 50 ไมโครลิตรของสารละลายการทำงานมาตรฐานที่มีความเข้มข้น 0.005 นาโนกรัม/ไมโครลิตรถูกฉีดเข้าไปในหัวฉีด ซึ่งสอดคล้องกับโอคราทอกซินเอ 0.25 นาโนกรัม เช่นเดียวกับสารละลายมาตรฐานอื่นๆ ที่มีความเข้มข้น 0.05 และ 0.10 นาโนกรัม/ µl ซึ่งสอดคล้องกับ 2.5 และ 5.0 ng ของ ochratoxin A ต่อการฉีด ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ เวลาเก็บรักษาสำหรับ ochratoxin A อยู่ในช่วง 4 ถึง 5 นาที จากข้อมูลที่ได้รับ กราฟการสอบเทียบจะถูกสร้างขึ้น (ขึ้นอยู่กับพื้นที่ของพีคโครมาโตกราฟีบนมวลของ ochratoxin A ในการฉีด)

8.2. การลงทะเบียนของผลลัพธ์

การคำนวณความเข้มข้นของ ochratoxin A ในตัวอย่างดำเนินการตามสูตร:

C (การป้องกัน A)- ความเข้มข้นของ ochratoxin A ในตัวอย่าง มก./กก.

เอ็ม- น้ำหนักตัวอย่างเพื่อการวิเคราะห์ g (25.0)

tคือมวลของ ochratoxin A ซึ่งสอดคล้องกับปริมาตรของสารละลาย A ที่ใส่เข้าไปในโครมาโตกราฟี ng;

วี 1 - ปริมาตรของสารละลายสำหรับการสกัด cm 3 (100)

ดี - ขีด จำกัด ของข้อผิดพลาดแน่นอน:

d - ขีด จำกัด ของข้อผิดพลาดสัมพัทธ์ของเทคนิค (ดัชนีความแม่นยำ), % (ตารางที่ 1)

หากเนื้อหาของ ochratoxin A ในตัวอย่างน้อยกว่าขีดจำกัดล่างของช่วงความเข้มข้นที่กำหนด ผลของการวิเคราะห์จะแสดงเป็น:

* 0.0001 มก./กก. - ขีดจำกัดการตรวจจับ

8.3. การตรวจสอบการยอมรับผลลัพธ์ของการกำหนดแบบคู่ขนาน

ความคลาดเคลื่อนที่อนุญาตระหว่างการวัดแบบขนาน (R) ถูกกำหนดตามขีดจำกัดความสามารถในการทำซ้ำ (r) (ตารางที่ 1):

R = 0,01 (r, %) × , มก./กก.

หากความคลาดเคลื่อนระหว่างคำจำกัดความคู่ขนานไม่เกินค่าที่อนุญาต:

จากนั้นนำค่าเฉลี่ยเลขคณิตมาจากการวิเคราะห์

เมื่อเกินมาตรฐานRควรทำการวัดซ้ำโดยใช้ตัวอย่างสำรอง

. การควบคุมคุณภาพของผลการวัด

ความถี่ของการควบคุมข้อผิดพลาดในการวัดขึ้นอยู่กับจำนวนการวัดการทำงานสำหรับช่วงเวลาที่ควบคุมและกำหนดโดยแผนควบคุม

ตัวอย่างควบคุมคือตัวอย่างการทำงานของวัตถุดิบอาหารและผลิตภัณฑ์อาหาร ตัวอย่างถูกนำมาและแบ่งออกเป็น 2 ส่วนเท่า ๆ กัน หนึ่งในนั้นไม่เปลี่ยนแปลง และปริมาณของ ochratoxin A สารละลายมาตรฐานจะถูกเพิ่มเข้าไปในส่วนอื่น ๆ เพื่อให้เศษส่วนของมวลในตัวอย่างเพิ่มขึ้น 50 - 100% เมื่อเทียบกับค่าเริ่มต้น ต้องใส่สารเติมแต่งลงในตัวอย่างก่อนเริ่มการเตรียมตัวอย่าง

ตัวอย่างทั้งสองได้รับการวิเคราะห์อย่างเคร่งครัดตามการกำหนดวิธีการและได้ผลลัพธ์ของการวิเคราะห์ตัวอย่างดั้งเดิม ( C (เช่น A)) และตัวอย่างที่มีการบวกด้วย ( กับ ¢ (neg. ก)). การพิจารณาดำเนินการภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน กล่าวคือ การวิเคราะห์ดำเนินการโดยนักวิเคราะห์คนหนึ่ง โดยใช้ชุดเครื่องมือวัดปริมาตร รีเอเจนต์ สารละลาย ฯลฯ ชุดเดียว

อัลกอริธึมสำหรับดำเนินการควบคุมข้อผิดพลาดในการปฏิบัติงานโดยใช้วิธีการเติมประกอบด้วยการเปรียบเทียบผลลัพธ์ของการกำหนดการควบคุม ซึ่งเท่ากับผลต่างระหว่างผลการวัดการควบคุมของตัวอย่างกับสารเติมแต่ง ( กับ ¢ (สีเหลืองสด)) ตัวอย่างที่ไม่มีสารเติมแต่ง ( C (การป้องกัน A)) และค่าของสารเติมแต่ง ( C ต่อ (แขน.A)) ด้วยมาตรฐานการควบคุมการปฏิบัติงาน (K). การตัดสินใจเกี่ยวกับข้อผิดพลาดที่น่าพอใจจะเกิดขึ้นเมื่อตรงตามเงื่อนไขต่อไปนี้ (เมื่อ R และ

อุณหภูมิแวดล้อมตั้งแต่ 15 ถึง 25 องศาเซลเซียส

ความชื้นสัมพัทธ์ในอากาศไม่เกิน 80% ที่ 25 องศาเซลเซียส

ความกดอากาศ 730 - 760 mm Hg.

แรงดันไฟฟ้าของแหล่งจ่ายไฟ: 210 - 220 V. ความถี่ AC: 45 - 50 Hz.

Ochratoxins ผลิตโดยเชื้อราบางชนิด แอสเปอร์จิลลัสและ เพนนิซิเลียม. ผู้ผลิตหลักคือ A.ochraceusและ P. viridicatum. เห็ดเหล่านี้พบได้ทุกที่ แอสเปอร์จิลลัสผลิต ochratoxins ที่อุณหภูมิสูงและความชื้นและ เพนนิซิเลียมแล้วที่อุณหภูมิ 5 องศาเซลเซียส Ochratoxins เป็นสารประกอบที่เป็นพิษสูงโดยมีผลทำให้ทารกอวัยวะพิการอย่างเด่นชัด

Ochratoxins A, B และ C เป็นกลุ่มของสารประกอบที่เกี่ยวข้องกับโครงสร้างที่เป็นไอโซคูมารินที่เกี่ยวข้องกับ หลี่- พันธะฟีนิลอะลานีนเปปไทด์ ขึ้นอยู่กับลักษณะของอนุมูล ochratoxins ประเภทต่าง ๆ จะเกิดขึ้น (ตารางที่ 2.3.)

Ochratoxin A เป็นสารผลึกไม่มีสี ละลายได้เล็กน้อยในน้ำ ละลายได้ปานกลางในตัวทำละลายอินทรีย์ที่มีขั้ว (เมทานอล คลอโรฟอร์ม) รวมทั้งในสารละลายโซเดียมคาร์บอเนตที่เป็นน้ำ ในรูปแบบที่บริสุทธิ์ทางเคมี สารจะไม่เสถียรและไวต่อแสงและอากาศมาก แต่ในสารละลายเอทานอล สารดังกล่าวจะไม่เปลี่ยนแปลงเป็นเวลานาน ในแสงยูวีจะมีแสงเรืองแสงสีเขียว

Ochratoxin B เป็นสารผลึก ซึ่งเป็นอะนาล็อกของ ochratoxin A ซึ่งไม่มีอะตอมของคลอรีน มีความเป็นพิษน้อยกว่าออคราทอกซินเอประมาณ 50 เท่า ในแสงยูวีจะมีสารเรืองแสงสีน้ำเงิน

Ochratoxin C เป็นสารอสัณฐานเอทิลเอสเทอร์ของ ochratoxin A ซึ่งมีความเป็นพิษใกล้เคียงกัน แต่ยังไม่พบว่าเป็นอาหารธรรมชาติและสารปนเปื้อนในอาหารสัตว์ ในแสง Y จะมีแสงเรืองแสงสีเขียวอ่อน

Ochratoxins เป็นของ mycotoxins ที่เป็นพิษ มีความเป็นพิษสูงต่อตับ ไต คุณสมบัติในการก่อมะเร็งและภูมิคุ้มกัน และผล hemolytic ที่เด่นชัด ในบรรดาออคราทอกซินนั้น โอคราทอกซินเอมีพิษมากที่สุด (LD 50 = 3.4 มก./กก. (ลูกไก่อายุหนึ่งวัน, ทางปาก)) เป็นพิษมากกว่าอะฟลาทอกซิน สารพิษจากเชื้อราอื่นๆ ในกลุ่มนี้มีระดับความเป็นพิษน้อยกว่า

กลไกการทำงานของ ochratoxins ทางชีวเคมี ระดับโมเลกุล และระดับเซลล์นั้นไม่เป็นที่เข้าใจกันดีนัก เป็นที่ทราบกันว่า ochratoxin A ยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนและเมแทบอลิซึมของคาร์โบไฮเดรต โดยเฉพาะอย่างยิ่ง glycogenosis โดยยับยั้งการทำงานของ phenylalanine, tRNA ซึ่งเป็นเอนไซม์เฉพาะที่มีบทบาทสำคัญในระยะเริ่มต้นของการสังเคราะห์โปรตีน

Ochratoxin A พบได้ในข้าวโพด ข้าวบาร์เลย์ ข้าวสาลี ข้าวโอ๊ต และข้าวบาร์เลย์ เป็นสิ่งสำคัญและเป็นอันตรายที่พบโอคราทอกซินเอในผลิตภัณฑ์จากปศุสัตว์ (แฮม เบคอน ไส้กรอก) ที่มีการปนเปื้อนสูงของเมล็ดพืชและอาหารสัตว์ Ochratoxin B นั้นหายาก Ochratoxins ยังส่งผลกระทบต่อผลไม้ของพืชสวนทั้งหมด แอปเปิลได้รับผลกระทบเป็นพิเศษ: มากถึง 50% ของพืชผลสามารถปนเปื้อนด้วยสารพิษจากเชื้อรา

ควรสังเกตว่า ochratoxins เป็นสารประกอบที่เสถียร ตัวอย่างเช่นในระหว่างการให้ความร้อนเป็นเวลานานของข้าวสาลีที่ปนเปื้อนด้วย ochratoxin A ปริมาณของมันลดลงเพียง 32% (ที่อุณหภูมิ 250–300ºС) ดังนั้น ความชุกในผลิตภัณฑ์อาหาร ความเป็นพิษ และความคงอยู่ของ ochratoxins จึงก่อให้เกิดอันตรายต่อสุขภาพของมนุษย์อย่างแท้จริง

วิธีการวิเคราะห์

Ochratoxin A พบได้ในอาหารออกซิไดซ์ ละลายได้ง่ายในตัวทำละลายอินทรีย์หลายชนิด ซึ่งใช้สำหรับการสกัด ที่ใช้กันมากที่สุดคือการสกัดด้วยคลอโรฟอร์มและสารละลายกรดฟอสฟอริกที่เป็นน้ำ ตามด้วยการทำให้บริสุทธิ์บนคอลัมน์และการกำหนดเชิงปริมาณโดยใช้วิธี TLC

มีการพัฒนาวิธี HPLC ด้วย ก่อนการวิเคราะห์ HPLC ตัวอย่างจะถูกจัดเตรียมไว้ดังนี้ ตัวอย่างที่บดแล้วจะได้รับการบำบัดด้วยส่วนผสมของกรดไฮโดรคลอริก 2 โมลาร์และสารละลายแมกนีเซียมคลอไรด์ 0.4 โมลาร์ หลังจากการทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน ให้สกัดด้วยโทลูอีนเป็นเวลา 60 นาที ส่วนผสมถูกหมุนเหวี่ยง เครื่องหมุนเหวี่ยงจะถูกส่งผ่านคอลัมน์ของซิลิกาเจลและล้างด้วยส่วนผสมของโทลูอีนและอะซิโตน (เฟสเคลื่อนที่) Ochratoxin A ถูกชะด้วยส่วนผสมของโทลูอีนและกรดอะซิติก (9:1) และทำให้แห้งที่ 40°C สารตกค้างจะละลายและกรอง การวิเคราะห์ดำเนินการโดยใช้ HPLC

นอกจากนี้ยังมีการพัฒนาชุดทดสอบทางชีวภาพของกุ้งและแบคทีเรียจำนวนหนึ่ง แต่ผลที่ได้รับไม่อนุญาตให้ใช้วิธีเหล่านี้ในการตรวจวัดโอคราทอกซิน

ความเข้มข้นของ ochratoxin A ในตัวอย่าง mg/kg

ขีดจำกัดข้อผิดพลาดสัมพัทธ์ (ดัชนีความแม่นยำ) (±d), %, R = 0,95

ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานความสามารถในการทำซ้ำ (s r), %

ขีด จำกัด ความสามารถในการทำซ้ำ ( r), %

ความสมบูรณ์ของการสกัดสาร%

4.2. อุปกรณ์เสริม


เครื่องเขย่าตัวอย่างประเภท АВУ-6С หรือใกล้เคียง
เครื่องระเหยแบบหมุน IR-1M พร้อมกับดักหรือที่คล้ายกัน
ตู้อบแห้งในห้องปฏิบัติการที่มีข้อผิดพลาดในการบำรุงรักษาอุณหภูมิ ±2.5 ในช่วง 50 ถึง 350 °C
ของใช้ในครัวเรือนตู้เย็น
เครื่องบดสำหรับห้องปฏิบัติการไฟฟ้า EM-3A หรือเครื่องวัดค่า pH ที่คล้ายกัน	มธ 46-22-236-79
เครื่องกวนแม่เหล็กแบบ MM 5 พร้อมแท่งกวน	มธ 25-11.834-80
ขวดรูปกรวยก้นแบน 250 cm3 พร้อม NSh 29, ประเภท KnKSh 250-29/32	GOST 10394-74
ขวดสกรูแก้วสีเข้ม (เลว) 7 cm3
ขวดปริมาตร ความจุ 100, 500, 1000 cm3 ชนิด 2-100-2,2-500-2
ห้องปฏิบัติการช่องทาง
ขวดรูปลูกแพร์ 10 ซม.3 มี NSh 14.5 พิมพ์ GrKSh-10-14/23	GOST 10394-72

4.3. รีเอเจนต์และวัสดุ

. เตรียมเข้าวัด

5.1. การเตรียมสารละลายมาตรฐานของ ochratoxin A

ในการเตรียมสารละลายในการเก็บรักษามาตรฐาน (ความเข้มข้นของ ochratoxin A คือ 10 ng/µl) ให้วางตัวอย่างผลึก ochratoxin A ขนาด 5 มก. ในขวดปริมาตรที่มีปริมาตร 500 cm3, 50 cm3 ของส่วนผสมของกรดโทลูอีน-อะซิติก (98:2% vol.) ถูกเติม ผสมให้ละเอียดจนละลายสารจนหมด และนำส่วนผสมของตัวทำละลายเดียวกันมาทำเครื่องหมาย ในการสร้างความเข้มข้นที่แน่นอนของโซลูชันการจัดเก็บ ความหนาแน่นของแสงจะถูกวัดที่ความยาวคลื่น 333 นาโนเมตร (D333) ความเข้มข้นของสารละลายคำนวณโดยสูตร:

สำหรับการเตรียมสารละลายการทำงานของ ochratoxin A ที่มีความเข้มข้น 0.005 0.05 และ 0.1 ng/µl ตามลำดับ 50, 500 และ 1,000 µl ของสารละลายที่มีความเข้มข้น 0.5 ng/µl ถูกนำไประเหยจนแห้งและละลายใน 5 cm3 ของเฟสเคลื่อนที่

5.2. การเตรียมสารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต pH = 7.4

การชั่งน้ำหนัก 1.15 กรัมของโซเดียมฟอสเฟตที่ถูกแทนที่ 12 ในน้ำด้วยมวล 1.15 g การชั่งน้ำหนักของโซเดียมของ monosubstituted 2-aqueous ที่มีมวล 0.124 g และการชั่งน้ำหนักของโซเดียมคลอไรด์ที่มีมวล 1.74 g จะถูกโอนไปที่ กระติกปริมาตรความจุ 100 ซม. 3 เติมน้ำกลั่น 10 - 20 ซม. 3 ผัดและนำปริมาตรของสารละลายในขวดไปทำเครื่องหมาย อายุการเก็บรักษา - 1 เดือนในตู้เย็น

5.3. การเตรียมของผสมตัวทำละลาย

โทลูอีน-อะซิติก กรด (98:2 % เกี่ยวกับ.).

เติมกรดอะซิติก 20 ซม.3 ลงในขวดปริมาตร 1000 ซม.3 และในขณะกวน ให้แต่งหน้าด้วยโทลูอีน อายุการเก็บรักษา - 1 เดือนในที่มืดและเย็น

อะซิโตไนไตรล์-น้ำ (60:40 % เกี่ยวกับ.).

เติมอะซิโตไนไทรล์ขนาด 600 ซม.3 ลงในขวดปริมาตร 1,000 ซม.3 และผสมน้ำจนเป็นเครื่องหมายขณะคน อายุการเก็บรักษา - 1 เดือนในที่มืดและเย็น

อะซิโตไนไตรล์-น้ำ (60:40 % เกี่ยวกับ.; pH = 3 ,0 ).

เติมอะซิโตไนไทรล์ขนาด 600 ซม. 3 ลงในขวดปริมาตรขนาด 1,000 ซม. 3 และผสมน้ำเดือดผสมให้เข้ากัน เมื่อเติมกรดฟอสฟอริก ค่า pH ของส่วนผสมจะถูกปรับเป็นค่าเท่ากับ 3.0 อายุการเก็บรักษา - 1 เดือนในที่มืดและเย็น

เมทานอล-อะซิติก กรด (98:2 % เกี่ยวกับ.).

เติมกรดอะซิติก 20 ซม.3 ลงในขวดปริมาตร 1000 ซม.3 และคนให้เข้ากันด้วยเมทานอล อายุการเก็บรักษา - 1 เดือนในที่มืดและเย็น

. การสุ่มตัวอย่างและการเตรียมตัวอย่างเพื่อการวิเคราะห์

6.1. การเลือกตัวอย่าง

"ข้าวโพด. กฎการยอมรับและวิธีการสุ่มตัวอย่าง" GOST 13586.3-83 ;

“ครูปา. กฎการยอมรับและวิธีการสุ่มตัวอย่าง" GOST 26312.1-84 ;

“แป้งและรำ วิธีการรับและสุ่มตัวอย่าง» GOST 27668-88 ;

“ผลิตภัณฑ์อาหารกระป๋อง การสุ่มตัวอย่างและการเตรียมการทดสอบ" GOST 8756.0-70.

6.2. การเตรียมตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์

6.2.1. การสกัด

ส่วนของตัวอย่างที่บดแล้ว 25 กรัมจะถูกใส่ลงในขวดทรงกรวยก้นแบนขนาด 250 ซม. และเติมส่วนผสมของน้ำอะซิโตไนไทรล์กับน้ำ 100 ซม. 3 (ปริมาตร 60:40%) สกัดในเชคเกอร์เป็นเวลา 30 นาที ส่วนผสมที่ได้จะถูกกรองผ่านตัวกรองกระดาษจีบแบบมีริบบิ้นสีน้ำเงิน ดึงสารกรอง 10 มล. และเพิ่มสารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 90 มล. pH = 7.4

6.2.2. การทำให้บริสุทธิ์ของสารสกัด

ผสมผลลัพธ์ 100 มล. กับคอลัมน์อิมมูโนแอฟฟินิตี้ในอัตรา 1-2 หยดต่อวินาที ล้างด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 20 ซม.3 pH = 7.4 Ochratoxin A ถูกชะด้วยกรดเมทานอล-อะซิติก 3 ซม. (98:2% โดยปริมาตร)

. การวัดผล

7.1. การเตรียมตัวอย่างทดสอบ

7.2. เงื่อนไขโครมาโตกราฟี

เงื่อนไข HPLC: เฟสเคลื่อนที่ - อะซิโตไนไทรล์-น้ำ (60:40% ปริมาตร; pH = 3.0); อัตราเฟสเคลื่อนที่ - 1.5 ซม. 3 / นาที

. กำลังประมวลผลผลการวัด

8.1. การสร้างการพึ่งพาอาศัยกันที่สำเร็จการศึกษา

ผลการวิเคราะห์นำเสนอในรูปแบบ (ด้วยความน่าจะเป็น R = 0,95):

D - ขีด จำกัด ข้อผิดพลาดแน่นอน:

d คือขีด จำกัด ของข้อผิดพลาดสัมพัทธ์ของเทคนิค (ดัชนีความแม่นยำ), % (ตารางที่ 1)

* 0.0001 มก./กก. - ขีดจำกัดการตรวจจับ

. ข้อกำหนดคุณสมบัตินักแสดง

เพื่อทำการวิเคราะห์ ochratoxin A ในธัญพืชและผลิตภัณฑ์จากธัญพืช บุคคลที่มีการศึกษาระดับอุดมศึกษาพิเศษหรือการศึกษาเฉพาะทางระดับมัธยมศึกษาที่เป็นเจ้าของเทคนิคการวิเคราะห์ HPLC ได้รับการฝึกอบรมที่เหมาะสมและมีประสบการณ์ในห้องปฏิบัติการเคมีแล้ว

. เงื่อนไขการวัด

อุณหภูมิแวดล้อมตั้งแต่ 15 ถึง 25 องศาเซลเซียส

ความชื้นสัมพัทธ์ในอากาศไม่เกิน 80% ที่ 25 องศาเซลเซียส

ความดันบรรยากาศ 730 - 760 mm Hg.

แรงดันไฟฟ้าของแหล่งจ่ายไฟ: 210 - 220 V. ความถี่ AC: 45 - 50 Hz.