Концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг
Границы относительной погрешности (показатель точности) (±d ), %, Р = 0,95
Стандартное отклонение повторяемости (s r ), %
Предел повторяемости (r ), %
Полнота извлечения веществ, %
4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, реактивы и материалы
4.1 . Средства измерений
4.2 . Вспомогательное оборудование
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С или аналогичный |
ТУ 64-1-2451 |
Ротационный испаритель ИР-1М с ловушкой или аналогичный |
ТУ 25-11917 |
Электрошкаф сушильный лабораторный с погрешностью поддержания температуры ±2,5 в интервале от 50 до 350 °С |
ТУ 16-531.639 |
Холодильник бытовой |
|
Мельница лабораторная электрическая ЭМ-3А или аналогичная рН-метр |
ТУ 46-22-236-79 |
Магнитная мешалка типа ММ 5 с перемешивающим стержнем |
ТУ 25-11.834-80 |
Колбы плоскодонные конические на 250 см 3 с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32 |
ГОСТ 10394-74 |
Флаконы стеклянные завинчивающиеся из темного стекла (вайл), объемом 7 см 3 |
|
Колбы мерные, вместимостью 100, 500, 1000 см 3 тип 2-100-2,2-500-2 |
|
Воронки лабораторные |
|
Колбы грушевидные на 10 см 3 с НШ 14,5, тип ГрКШ-10-14/23 |
ГОСТ 10394-72 |
4.3 . Реактивы и материалы
Натрий фосфорно-кислый однозамещенный, 2-водный, чда |
|
Натрий хлорид, хч |
|
Ацетонитрил, осч, сорт 0 |
|
Метанол, осч |
|
Кислота фосфорная, осч |
ТУ 2612-014-00203677-97 |
Кислота уксусная ледяная, хч |
|
Толуол, чда |
|
Иммуноаффинные колонки Ochraprep (R-Biopharm, Великобритания) |
. Подготовка к выполнению измерений
5.1 . Приготовление стандартных растворов охратоксина А
Для приготовления стандартного раствора хранения (концентрация охратоксина А - 10 нг/мкл) навеску кристаллического охратоксина А массой 5 мг помещают в мерную колбу объемом 500 см 3 , приливают 50 см 3 смеси толуол-уксусная кислота (98:2 % об.), тщательно перемешивают до полного растворения вещества и доводят той же смесью растворителей до метки. Для установления точной концентрации раствора хранения измеряют его оптическую плотность при длине волны 333 нм (Д 333). Концентрацию раствора вычисляют по формуле:
Далее 5 см 3 стандартного раствора охратоксина А с концентрацией 10 нг/мкл разбавляют смесью толуол-уксусная кислота (98: 2 % об.) до объема 100 см 3 , получая рабочий раствор с концентрацией 0,5 нг/мкл.
Для приготовления рабочих растворов охратоксина А с концентрацией 0,005; 0,05 и 0,1 нг/мкл отбирают соответственно 50, 500 и 1000 мкл раствора с концентрацией 0,5 нг/мкл, упаривают досуха и растворяют в 5 см 3 подвижной фазы.
Раствор хранения охратоксина А содержат в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) до одного года и используют для приготовления рабочих стандартных растворов. Рабочие стандартные растворы хранят в вайлах из темного стекла в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) в течение 1 месяца.
Перед использованием рабочих стандартных растворов их следует довести до комнатной температуры и только после этого следует открывать пробки.
5.2 . Приготовление фосфатного буферного раствора, рН = 7,4
Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 см 3 , добавляют 10 - 20 см 3 дистиллированной воды. Перемешивают и доводят объем раствора в колбе до метки. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.
5.3 . Приготовление смесей растворителей
Толуол -уксусная кислота (98:2 % об .).
В мерную колбу на 1000 см 3 вносят 20 см 3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят толуолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.
Ацетонитрил -вода (60:40 % об .).
В мерную колбу на 1000 см 3 вносят 600 см 3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят водой до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.
Ацетонитрил -вода (60:40 % об .; рН = 3 ,0 ).
В мерную колбу на 1000 см 3 вносят 600 см 3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят бидистиллированной водой до метки. Внесением фосфорной кислоты подводят рН смеси до величины, равной 3,0. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.
Метанол -уксусная кислота (98:2 % об .).
В мерную колбу на 1000 см 3 вносят 20 см 3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят метанолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.
. Отбор и подготовка проб для анализа
6.1 . Отбор проб
Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией:
«Зерно. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 13586.3-83 ;
«Крупа. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 26312.1-84 ;
«Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб» ГОСТ 27668-88 ;
«Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию» ГОСТ 8756.0-70 .
Пробы для анализа, представительные по концентрации микотоксинов для всей партии, следует отбирать из предварительно гомогенизированного среднего (исходного) образца массой 2 кг.
6.2 . Подготовка проб для анализа
Отобранные пробы измельчают в течение 1 - 2 мин в лабораторной мельнице. При этом используют две параллельные пробы.
6.2.1 . Экстракция
Навеску 25 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 см, добавляют 100 см 3 смеси ацетонитрил-вода (60:40 % об.). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр «синяя лента». Отбирают 10 см 3 фильтрата и добавляют 90 см фосфатного буферного раствора, рН = 7,4.
6.2.2 . Очистка экстракта
На иммуноаффинную колонку наносят 100 мл полученной смеси со скоростью 1 - 2 капли в секунду, промывают 20 см 3 фосфатного буферного раствора, рН = 7,4. Охратоксин А элюируют 3 см 3 смеси метанол-уксусная кислота (98: 2 % об.).
. Выполнение измерений
7.1 . Приготовление тестового образца
Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 400 мкл подвижной фазы (раствор А).
7.2 . Условия хроматографирования
Условия ВЭЖХ: подвижная фаза - ацетонитрил-вода (60:40 % об.; рН = 3,0); скорость подвижной фазы - 1,5 см 3 /мин.
Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 333 нм, на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 466 нм.
Для анализа проб в инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 50 мкл тестового образца (раствора А). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с охратоксином А, рассчитывают массу охратоксина А во вколе с помощью градуировочного графика.
. Обработка результатов измерения
8.1 . Построение градуированной зависимости
Для построения градуировочного графика проводят хроматографический анализ серии рабочих растворов стандартов. В инжектор с помощью микрошприца вводят 50 мкл рабочего раствора стандарта с концентрацией 0,005 нг/мкл, что соответствует 0,25 нг охратоксина А. Подобное делается для других стандартных растворов с концентрациями 0,05 и 0,10 нг/мкл, что в свою очередь соответствует 2,5 и 5,0 нг охратоксина А во вколе. В указанных условиях время удерживания находится для охратоксина А в диапазоне от 4 до 5 мин. На основании полученных данных строят градуировочный график (зависимость площади хроматографического пика от массы охратоксина А во вколе).
8.2 . Оформление результатов
Расчет концентрации охратоксина А в пробе проводится по формуле:
С (охр. А) - концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг;
М - масса навески для анализа, г (25,0);
т - масса охратоксина А, соответствующая введенному в хроматограф объему раствора А, нг;
V 1 - объём раствора для экстракции, см 3 (100);
D - граница абсолютной погрешности:
d - граница относительной погрешности методики (показатель точности), % (табл. 1).
Если содержание охратоксина А в пробе менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
* 0,0001 мг/кг - предел обнаружения.
8.3 . Проверка приемлемости результатов параллельных определений
Допустимое расхождение между параллельными измерениями (R ) определяют на основании предела повторяемости (r ) (табл. 1):
R = 0,01 (r , %) × , мг/кг
Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого:
то среднее арифметическое принимают за результат анализа.
При превышении норматива R следует повторить измерения, используя резервные пробы.
. Контроль качества результатов измерений
Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.
Образцами контроля являются рабочие пробы продовольственного сырья и пищевых продуктов. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют такое количество раствора стандарта охратоксина А, чтобы его массовая доля в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50 - 100 %. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.
Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы (С (отр.А) ) и пробы с добавкой (С ¢ (отр.А) ). Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ проводит один аналитик, с использованием одного набора мерной посуды, реактивов, растворов и т, д.
Алгоритм проведения
оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в
сравнении результата контрольного определения, равного разности между
результатом контрольного измерения пробы с добавкой (С
¢
(охр.А)
), пробы без добавки (С (охр.А)
) и величиной
добавки (С доб(охр.А)
) с нормативом оперативного контроля (K
). Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении
следующего условия (при Р
и
Температура окружающего
воздуха от 15 до 25 °С.
Относительная влажность
воздуха не более 80 % при 25 °С.
Атмосферное давление 730 -
760 мм рт.ст.
Напряжение электропитания:
210 - 220 В. Частота переменного тока: 45 - 50 Гц.
Охратоксины вырабатываются некоторыми видами грибов Aspergillus и Penicillium . Основными продуцентами являются A.ochraceus и P.viridicatum . Эти грибы встречаются повсеместно. Aspergillus вырабатывает охратоксины при повышенной температуре и влажности, а Penicillium уже при 5ºС. Охратоксины – соединения высокой токсичности, с ярко выраженным тератогенным эффектом.
Охратоксины А,В, и С представляют собой группу близких по структуре соединений, являющихся изокумаринами, связанными с L -фенилаланином пептидной связью. В зависимости от природы радикалов образуются охратоксины различных типов (табл. 2.3.).
Охратоксин А – бесцветное кристаллическое вещество, слабо растворимое в воде, умеренно растворимое в полярных органических растворителях (метанол, хлороформ), а также в водном растворе карбоната натрия. В химически чистом виде он нестабилен и очень чувствителен к воздействию света и воздуха, однако в растворе этанола может сохраняться без изменений в течение длительного времени. В УФ свете обладает зеленой флуоресценцией.
Охратоксин В – кристаллическое вещество, аналог охратоксина А, не содержащий атом хлора. Он примерно в 50 раз менее токсичен, чем охратоксин А. В УФ-свете обладает голубой флуоресценцией.
Охратоксин С – аморфное вещество, этиловый эфир охратоксина А, близок к нему по токсичности, но в качестве природного загрязнителя пищевых продуктов и кормов не обнаружен. В У-свете обладает бледно-зеленой флуоресценцией.
Охратоксины принадлежат к токсичным микотоксинам, обладают высокой токсичностью для печени, почек, тератогенными и иммунодепрессивными свойствами, выраженным гемолитическим эффектом. Из охратоксинов наиболее токсичен охратоксин А (ЛД 50 = 3,4 мг/кг, (однодневные цыплята, перорально)). Он более токсичен, чем афлатоксины. Другие микотоксины этой группы на порядок менее токсичны.
Биохимические, молекулярные, клеточные механизмы действия охратоксинов изучены недостаточно. Известно, что охратоксин А подавляет синтез протеина и метаболизм углеводов, в частности гликоногеноз, путем ингибирования активности фенилаланин – т-РНК – специфического фермента, играющего ключевую роль в начальной стадии синтеза протеина.
Охратоксин А обнаружен в кукурузе, ячмене, пшенице, овсе, ячмене. Важен и опасен тот факт, что при высоком загрязнении кормового зерна и комбикормов охратоксин А обнаруживается в животноводческой продукции (ветчина, бекон, колбасы). Охратоксин В встречается редко. Охратоксины также поражают все плоды садово-огородных культур. Особенно сильно поражаются яблоки: до 50% урожая может загрязняться микотоксинами.
Следует отметить, что охратоксины являются стабильными соединениями. Так, например, при длительном прогревании пшеницы, загрязненной охратоксином А, его содержание снижалось лишь на 32% (при температуре 250–300ºС). Таким образом, распространненость в продуктах питания, токсичность и устойчивость охратоксинов создают реальную опасность для здоровья человека.
Методы анализа
Охратоксин А содержится в окисленных продуктах. Он легко растворяется во многих органических растворителях, что используется для экстракции. Наиболее часто используется экстракция хлороформом и водным раствором фосфорной кислоты с последующей очисткой на колонке и количественное определение с использованием метода ТСХ.
Разработан также метод ВЭЖХ. Перед ВЭЖХ анализом образец готовят следующим образом. Измельченный образец обрабатывают смесью 2 М соляной кислоты и 0,4 М раствора хлорида магния. После гомогенизации экстрагируют толуолом в течение 60 мин. Смесь центрифугируют. Центрифугат пропускают через колонку с силикагелем и промывают смесью толуола с ацетоном (подвижная фаза). Охратоксин А элюируется смесью толуола с уксусной кислотой (9:1) и высушивается при 40°С. Остаток растворяют и фильтруют. Анализ проводят с использованием ВЭЖХ.
Кроме того, разработан ряд биопроб на креветках, бактериях, но полученные результаты не позволили использовать эти методы для определения охратоксинов.
Концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг
Границы относительной погрешности (показатель точности) (±d), %, Р = 0,95
Стандартное отклонение повторяемости (sr ), %
Предел повторяемости (r ), %
Полнота извлечения веществ, %
4.2 . Вспомогательное оборудование
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С или аналогичный |
|
Ротационный испаритель ИР-1М с ловушкой или аналогичный |
|
Электрошкаф сушильный лабораторный с погрешностью поддержания температуры ±2,5 в интервале от 50 до 350 °С |
|
Холодильник бытовой |
|
Мельница лабораторная электрическая ЭМ-3А или аналогичная рН-метр |
ТУ 46-22-236-79 |
Магнитная мешалка типа ММ 5 с перемешивающим стержнем |
ТУ 25-11.834-80 |
Колбы плоскодонные конические на 250 см3 с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32 |
ГОСТ 10394-74 |
Флаконы стеклянные завинчивающиеся из темного стекла (вайл), объемом 7 см3 |
|
Колбы мерные, вместимостью 100, 500, 1000 см3 тип 2-100-2,2-500-2 |
|
Воронки лабораторные |
|
Колбы грушевидные на 10 см3 с НШ 14,5, тип ГрКШ-10-14/23 |
ГОСТ 10394-72 |
4.3 . Реактивы и материалы
. Подготовка к выполнению измерений
5.1 . Приготовление стандартных растворов охратоксина А
Для приготовления стандартного раствора хранения (концентрация охратоксина А - 10 нг/мкл) навеску кристаллического охратоксина А массой 5 мг помещают в мерную колбу объемом 500 см3, приливают 50 см3 смеси толуол-уксусная кислота (98:2 % об.), тщательно перемешивают до полного растворения вещества и доводят той же смесью растворителей до метки. Для установления точной концентрации раствора хранения измеряют его оптическую плотность при длине волны 333 нм (Д333). Концентрацию раствора вычисляют по формуле:
Для приготовления рабочих растворов охратоксина А с концентрацией 0,005; 0,05 и 0,1 нг/мкл отбирают соответственно 50, 500 и 1000 мкл раствора с концентрацией 0,5 нг/мкл, упаривают досуха и растворяют в 5 см3 подвижной фазы.
Раствор хранения охратоксина А содержат в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) до одного года и используют для приготовления рабочих стандартных растворов. Рабочие стандартные растворы хранят в вайлах из темного стекла в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) в течение 1 месяца.
Перед использованием рабочих стандартных растворов их следует довести до комнатной температуры и только после этого следует открывать пробки.
5.2 . Приготовление фосфатного буферного раствора, рН = 7,4
Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 10 - 20 см3 дистиллированной воды. Перемешивают и доводят объем раствора в колбе до метки. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.
5.3 . Приготовление смесей растворителей
Толуол -уксусная кислота (98:2 % об .).
В мерную колбу на 1000 см3 вносят 20 см3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят толуолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.
Ацетонитрил -вода (60:40 % об .).
В мерную колбу на 1000 см3 вносят 600 см3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят водой до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.
Ацетонитрил -вода (60:40 % об .; рН = 3 ,0 ).
В мерную колбу на 1000 см3 вносят 600 см3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят бидистиллированной водой до метки. Внесением фосфорной кислоты подводят рН смеси до величины, равной 3,0. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.
Метанол -уксусная кислота (98:2 % об .).
В мерную колбу на 1000 см3 вносят 20 см3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят метанолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.
. Отбор и подготовка проб для анализа
6.1 . Отбор проб
Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией:
«Зерно. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 13586.3-83 ;
«Крупа. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 26312.1-84 ;
«Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб» ГОСТ 27668-88 ;
«Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию» ГОСТ 8756.0-70 .
Пробы для анализа, представительные по концентрации микотоксинов для всей партии, следует отбирать из предварительно гомогенизированного среднего (исходного) образца массой 2 кг.
6.2 . Подготовка проб для анализа
Отобранные пробы измельчают в течение 1 - 2 мин в лабораторной мельнице. При этом используют две параллельные пробы.
6.2.1 . Экстракция
Навеску 25 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 см, добавляют 100 см3 смеси ацетонитрил-вода (60:40 % об.). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр «синяя лента». Отбирают 10 см3 фильтрата и добавляют 90 см фосфатного буферного раствора, рН = 7,4.
6.2.2 . Очистка экстракта
На иммуноаффинную колонку наносят 100 мл полученной смеси со скоростью 1 - 2 капли в секунду, промывают 20 см3 фосфатного буферного раствора, рН = 7,4. Охратоксин А элюируют 3 см3 смеси метанол-уксусная кислота (98: 2 % об.).
. Выполнение измерений
7.1 . Приготовление тестового образца
Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 400 мкл подвижной фазы (раствор А).
7.2 . Условия хроматографирования
Условия ВЭЖХ: подвижная фаза - ацетонитрил-вода (60:40 % об.; рН = 3,0); скорость подвижной фазы - 1,5 см3/мин.
Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 333 нм, на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 466 нм.
Для анализа проб в инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 50 мкл тестового образца (раствора А). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с охратоксином А, рассчитывают массу охратоксина А во вколе с помощью градуировочного графика.
. Обработка результатов измерения
8.1 . Построение градуированной зависимости
Для построения градуировочного графика проводят хроматографический анализ серии рабочих растворов стандартов. В инжектор с помощью микрошприца вводят 50 мкл рабочего раствора стандарта с концентрацией 0,005 нг/мкл, что соответствует 0,25 нг охратоксина А. Подобное делается для других стандартных растворов с концентрациями 0,05 и 0,10 нг/мкл, что в свою очередь соответствует 2,5 и 5,0 нг охратоксина А во вколе. В указанных условиях время удерживания находится для охратоксина А в диапазоне от 4 до 5 мин. На основании полученных данных строят градуировочный график (зависимость площади хроматографического пика от массы охратоксина А во вколе).
Результат анализа представляют в виде (при вероятности Р = 0,95):
D - граница абсолютной погрешности:
d - граница относительной погрешности методики (показатель точности), % (табл. 1).
* 0,0001 мг/кг - предел обнаружения.
. Требования к квалификации исполнителя
К выполнению анализа охратоксина А в зерне и зернопродуктах допускаются лица со специальным высшим образованием или средним специальным образованием, владеющие техникой ВЭЖХ-анализа, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие опыт работы в химической лаборатории.
. Условия выполнения измерений
Температура окружающего воздуха от 15 до 25 °С.
Относительная влажность воздуха не более 80 % при 25 °С.
Атмосферное давление 730 - 760 мм рт.ст.
Напряжение электропитания: 210 - 220 В. Частота переменного тока: 45 - 50 Гц.